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血清脂蛋白电泳操作步骤 - 尊龙凯时生物医疗方案

来源:毛敬伦 日期:2025-03-22

尊龙凯时生物医学研究中的血清脂蛋白电泳实验原理包括对血清脂蛋白进行预染,使用脂类染料(如苏丹黑或油红O),随后将预染的血清置于琼脂糖凝胶板上进行电泳分离。在电场作用下,脂蛋白会朝正极移动,从而形成多个分离的区带。

血清脂蛋白电泳操作步骤 - 尊龙凯时生物医疗方案

实验所需试剂与器材包括:

1. 巴比缓冲液(pH 8.6,离子强度 0.075):由巴比/妥钠154克、巴比/妥276克、EDTA酸0.292克溶于水后定容至1000毫升。

2. 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 8.6):由三羟甲基/氨基甲烷121.2克、EDTA酸0.29克、NaCl 15.85克溶于水后定容至1000毫升。

3. 琼脂糖凝胶:0.45克琼脂糖、50毫升三羟甲基/氨基甲烷缓冲液、50毫升水加热至沸腾,待琼脂糖完全溶解后立刻停止加热。

4. 挖槽工具:制作切口刀的刀片长度为15毫米的刀片,中央夹入有机玻璃或木片并用螺丝固定,使刀片间距保持在15毫米。挖槽小匙可用直径15毫米的铜丝制成,长度约6厘米,一端锤平并用砂纸磨光。

5. 电泳槽和电泳仪器与血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的设备相同。

实验操作步骤如下:

1. 预染血清:取0.2毫升血清与0.2毫升苏丹黑染色液混合,置于37℃水浴中染色30分钟,随后以2000转/分离心约5分钟。

2. 制备琼脂糖凝胶板:将已配制的0.45%琼脂糖凝胶在沸水浴中加热至融化,使用吸管取出浇注于载玻片上,每片约25毫升,静置约半小时直至凝固(在高温环境下需延长时间,必要时可放入冰箱以加速凝固)。

3. 点加血清:在凝固的琼脂糖凝胶板约2厘米处使用切口刀垂直切入胶体后立即取出,再用铜丝小匙将小条凝胶小心取出,使用小片滤纸吸干小槽内水分,利用血色素吸管取约15微升的预染血清注入小槽内。

4. 电泳:将加过血清的凝胶板平行放入电泳槽中,样品位于阴极一端。将浸润于巴比/妥缓冲液的三层纱布轻轻紧贴在凝胶板两端,纱布的另一端则浸于电泳槽中的缓冲液。接通电源,电压设定为120~130V,每片电流为3~4mA。电泳进行约15至55分钟后可观察到分离的色带。

注意事项:

1. 电泳样品应为新鲜的空腹血清。

2. 每块凝胶可平行挖两条小槽,以便同时加两个样品。

3. 若使用与小槽形状和大小相同的有机玻璃片,在琼脂糖凝固前固定于适当位置,待凝固后取出,留下的小槽可直接加样,无需挖槽。

4. 若需保存电泳样本,可以将电泳后的凝胶板(连同玻片)放入清水中浸泡以脱盐2小时,然后置于烘箱(约80℃)烘干。

结果及临床意义:

1. 正常人血清脂蛋白可显示三条区带,从负极到正极分别为β-脂蛋白(最深)、前β-脂蛋白(最浅)和α-脂蛋白(较前β-脂蛋白稍深),原点处不应有乳糜微粒。

2. 若前β-脂蛋白比α-脂蛋白深,结合血清甘油三酯显著升高且胆固醇正常或略高,则可判定为Ⅳ型高脂蛋白血症。

3. 如果β-脂蛋白区带明显加深,同时血清总胆固醇显著增高且甘油三酯正常,则为Ⅱa型;若血清总胆固醇增高且前β-脂蛋白稍微溶解则归为Ⅱb型。

4. 若β-和前β-两区带未分离且连在一起称为“宽β区带”,同时血清甘油三酯和胆固醇均增高,则可定为Ⅲ型。

5. 如果原点出现乳糜微粒,而β-和前β-均正常或降低,且结合血清甘油三酯明显升高,则可判定为Ⅰ型。

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